MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA SARS-CoV-2 INFEKCIJE - International Burch University
Odsjek za genetiku i bioinženjering – Savršen spoj, nauke, istraživanja, praktičnog rada i kreativnosti
May 8, 2020
K O N K U R S: Za imenovanje dekana Fakulteta za inžinjering i prirodne nauke visokoškolske ustanove Internacionalni Burč univerzitet – International Burch University
May 8, 2020

MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA SARS-CoV-2 INFEKCIJE

COVID-19 kako odrediti prisustvo?

Larisa Bešić, Adna Ašić, Amina Kurtović-Kozarić, Odsjek za genetiku i bioinženjerstvo

Početkom decembra 2019. godine zabilježeni su prvi slučajevi pneumonije nepoznatog porijekla u Wuhanu, glavnom gradu provincije Hubei u Kini. Ubrzo je otkriven i uzročnik, potpuno novi RNK betakoronavirus, sličan postojećem SARS-CoV virusu, te je iz tog razloga nazvan SARS-CoV-2. Novi virus je pokazao 85% podudaranja sa SARS-CoV virusom koji napada slijepe miševe, i ljudske ACE2 receptore za ulazak u ljudske ćelije (1-4).

Šta je koronavirus?

Koronavirusi su envelopirani nesegmentiratni RNK virusi pozitivnog smisla (Slika 1), koji pripadaju porodici Coronaviridae, a redu Nidovirales, a koji su zastupljeni među ljudima, drugim sisarima, te pticama i uzrokuju respiratorne, hepatične i neurološke bolesti (2-4). Bitno je napomenuti da je broj smrtnih slučajeva osoba zaraženih SARS-CoV-2 sojem manji nego sa SARS-CoV ili MERS-CoV, a respiratorne poteškoće prilikom hospitalizacije povezane su sa težim slučajevima infekcije (1).


Slika 1. Građa koronavirusa. Strukturni proteini na peplomerima (S) omogućavaju vezivanje na receptore ćelije domaćina i fuziju membrana prilikom infekcije. (Ilustracija pripremljena u programu BioRender.)

U naučnom istraživanju koje je sprovedeno ove godine na 1099 zaraženih ispitanika, utvrđeno je da je srednja vrijednost perioda inkubacije četiri dana, srednja vrijednost starosne dobi pacijenata s potvrđenim slučajem virusa 47 godina, od čega je otprilike 0,9% pacijenata mlađe od 15 godina, te da je otprilike 43,8% pacijenata ženskog spola. Najčešći simptom kod zaraženih osoba je groznica (43,8%), što je praćeno kašljem (67,8%), dok su mučnina (5%) i proljev (3,8%) manje zastupljeni simptomi (1,5). Oko 23,7% pozitivnih slučajeva boluje od već postojuće bolesti, kao što su povišen krvni pritisak ili hronična opstruktivna bolest pluća. U istom istraživanju, utvrđeno je da su na osnovu ozbiljnosti simptoma 926 (84,3%) pacijenata uvršteni u kategoriju blažih simptoma, dok je 173 (15,7%) pacijenta uvršteno u kategoriju težih simptoma. Pacijenti sa težim simptomima su pretežno starije osobe koje su bolovale od drugih bolesti prije infekcije. Dužina boravka u bolnici je bila oko 12 dana, a 91% hospitaliziranih ispitanika prvobitno je dijagnosticirano pneumonijom (1).

Prema preporuci Centra za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC), prioritetno testiranje se provodi za tri kategorije osoba: hospitalizirane pacijente sa simptomima COVID-19, druge simptomatske osobe sa povišenim rizikom od fatalnog ili lošeg ishoda, te osobe koje su imale bliski kontakt sa osobama koje su potvrđeni ili mogući slučajevi COVID-19 infekcije u roku od 14 dana od početka bolesti, ili su putovali u područje pogođeno pandemijom (6). Testiranje šire populacije je urađeno na Islandu, gdje je 13% ispitanika bilo pozitivno na SARS-CoV-2, slično kao i istraživanje iz grada Heinsberga u Njemačkoj, gdje je 14% ispitanika bilo pozitivno (7-8). Testiranje trudnica pred porođaj u New Yorku je pokazalo da je 15,4% pozitivno na SARS-CoV-2, gdje je većina pozitivnih trudnica (13.5%) bila bez simptoma bolesti (9).

Kako se testira prisustvo virusa?

Molekularna dijagnostika je trenutno zlatni standard za testiranje na SARS-CoV-2, a koristi se qRT-PCR metoda (kvantitativna lančana rekacija polimerazom nakon reverzne transkripcije). Uzorci se uzimaju iz gornjeg respiratornog trakta, a najčešće je u pitanju bris grla i nosa prikupljen nazofaringealno, s tim da se transport uzoraka do laboratorije vrši tako što se bris stavi na podlogu koja će doprinijeti očuvanju viralne RNK. Serum i urin su uglavnom negativni na prisustvo viralne nukleinske kiseline, bez obzira na stadij bolesti (6).

Nakon izolacije genetičkog materijala virusa, ribonukleinske kiseline (RNK), ista se procesom reverzne transkripcije prevodi u dvolančanu DNK. Test Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) se bazira na umnožavanju dva gena specifična za SARS-CoV-2, i to gen za RNK zavisnu RNK polimerazu (RdRP) i gen ovojnice (gen E). S druge strane, test razvijen od strane CDC-ja se bazira na amplifikaciji (umnožavanju) dvije regije gena nukleokapsida N1 i N2 i ljudskog RNaza P gena, kako bi se potvrdilo da je izolacija viralne RNK bila uspješna. Ukoliko je virus prisutan u testiranom uzorku, doći će do amplifikacije gore navedenih ciljanih regija viralnog genoma u toku reakcije koja se ciklično ponavlja 45 puta. Prateći porast prisutnosti viralnih gena u stvarnom vremenu, moguće je odrediti da li je nalaz pozitivan ili ne (10). Sažetak procesa molekularnog testiranja predstavljen je na ilustraciji (Slika 2).


Slika 2. Proces molekularnog dijagnostičkog testa na SARS-CoV-2 (ilustracija pripremljena u programu BioRender).

WHO također preporučuje korištenje pozitivnih i negativnih kontrola u svakoj reakciji, kako bi se osigurala tačnost rezultata. Tako se preporučuje korištenje negativne kontrole za izolaciju RNK i vode kao negativne kontrole za PCR reakciju, te pozitivne kontrole za izolaciju RNK i PCR. Pozitivan rezultat je potrebno potvrditi ponavljanjem PCR reakcije na istom uzorku ili testiranjem istog uzorka u drugoj laboratoriji (11).

Ukoliko se osigura praćenje svih preporuka za kontrolu kvalitete, molekularno testiranje na SARS-CoV-2 je iznimno osjetljivo i specifično, uz minimalnu opasnost od lažno pozitivnih ili lažno negativnih rezultata. Prema podacima Ministarstva civilnih poslova Bosne i Hercegovine od 23. aprila 2020. godine u 12:00 sati, u BiH su testirane 21432 osobe (6264 testiranih na milion stanovnika; Slika 3), od čega je 14131 342 potvrđenih slučajeva (Slika 4) sa 54 smrtna ishoda (Slika 5). Pod nadzorom se nalazi 9307 osoba, a izliječenih je 485 (12). Slika 6 prikazuje usporedbu procenta zaraženih u BiH sa globalnom zastupljenosti koronavirusa.

Svi navedeni podaci upućuju na važnost ispravne molekularne dijagnostike zaraze koronavirusom, kako zbog prisutnosti iste u BiH, tako i zbog pandemije na svjetskom nivou. Kroz dodiplomski studij na Internacionalnom Burch univerzitetu, studenti se na laboratorijskim vježbama upoznaju sa metodama izolacije, analize i amplifikacije nukleinskih kiselina i na taj način stiču teoretsko i praktično znanje neophodno za rad u oblasti molekularne dijagnostike, pa tako i u provođenju testova na infekciju koronavirusom. Također, naši studenti Master i doktorskog studija aktivno rade na praćenju infekcije, a isti trend planiramo nastaviti i u budućnosti kroz realizaciju Master teza na temu infekcije SARS-CoV-2, te objavu naučnih radova koji problematiziraju ovu temu.

Slika 3. Procenat testiranih ispitanika na milion stanovnika u BiH.

Literatura:

  1. Guan, W. J., Ni, Z. Y., Hu, Y., Liang, W. H., Ou, C. Q., He, J. X., … & Du, B. (2020). Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. doi: 10.1056/NEJMoa2002032.
  2. Huang, C., Wang, Y., Li, X., Ren, L., Zhao, J., Hu, Y., … & Cheng, Z. (2020). Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. The Lancet395(10223), 497-506.
  3. Perlman, S. (2020). Another decade, another coronavirus. New England Journal of Medicine, 382, 760-762
  4. Zhu, N., Zhang, D., Wang, W., Li, X., Yang, B., Song, J., … & Niu, P. (2020). A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. New England Journal of Medicine. doi: 10.1056/NEJMoa2001017.
  5. McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., & Bartee, E. (2009). Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews Immunology9(9), 645-655.
  6. Cheng, M. P., Papenburg, J., Desjardins, M., Kanjilal, S., Quach, C., Libman, M., Dittrich, S., & Yansouni, C. P. (2020). Diagnostic Testing for Severe Acute Respiratory Syndrome-Related Coronavirus-2: A Narrative Review. Annals of Internal Medicine. doi: 10.7326/M20-1301.
  7. Gudbjartsson, D. F., Helgason, A., Jonsson, H., Magnusson, O. T., Melsted, P., Norddahl, G. L., … &Stefansson, K. (2020). Spread of SARS-CoV-2 in the Icelandic Population. New England Journal of Medicine. doi: 10.1056/NEJMoa2006100.
  8. Streeck, H., Hartmann, G., Exner, M., &Schmid, M.(2020). Vorläufiges Ergebnis und Schlussfolgerungen der COVID-19 Case-Cluster-Study (Gemeinde Gangelt). Pristupljeno 24. aprila 2020. godine na
  9. Sutton, D., Fuchs, K., D’Alton, M., & Goffman, D. (2020). Universal screening for SARS-CoV-2 in women admitted for delivery. New England Journal of Medicine. doi: 10.1056/NEJMc2009316.
  10. Corman, V. M., Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, D. K., …, & Drosten, C. (2020). Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance25(3), 2000045.
  11. World Health Organization. (2020). Use of laboratory methods for SARS diagnosis. Pristupljeno 21. aprila 2020. godine na https://www.who.int/csr/sars/labmethods/en/
  12. Ministarstvo civilnih poslova Bosne i Hercegovine. (2020). Službene informacije o koronavirusu u BiH. Pristupljeno 17. maja 2020. godine na http://mcp.gov.ba/publication/read/sluzbene-informacije-o-koronavirusu-covid-19