MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA SARS-CoV-2 INFEKCIJE

Larisa Bešić, Adna Ašić, Amina Kurtović-Kozarić, Odsjek za genetiku i bioinženjerstvo

Početkom decembra 2019. godine zabilježeni su prvi slučajevi pneumonije nepoznatog porijekla u Wuhanu, glavnom gradu provincije Hubei u Kini. Ubrzo je otkriven i uzročnik, potpuno novi RNK betakoronavirus, sličan postojećem SARS-CoV virusu, te je iz tog razloga nazvan SARS-CoV-2. Novi virus je pokazao 85% podudaranja sa SARS-CoV virusom koji napada slijepe miševe, i ljudske ACE2 receptore za ulazak u ljudske ćelije (1-4).

Šta je koronavirus?

Koronavirusi su envelopirani nesegmentiratni RNK virusi pozitivnog smisla (Slika 1), koji pripadaju porodici Coronaviridae, a redu Nidovirales, a koji su zastupljeni među ljudima, drugim sisarima, te pticama i uzrokuju respiratorne, hepatične i neurološke bolesti (2-4). Bitno je napomenuti da je broj smrtnih slučajeva osoba zaraženih SARS-CoV-2 sojem manji nego sa SARS-CoV ili MERS-CoV, a respiratorne poteškoće prilikom hospitalizacije povezane su sa težim slučajevima infekcije (1).

U naučnom istraživanju koje je sprovedeno ove godine na 1099 zaraženih ispitanika, utvrđeno je da je srednja vrijednost perioda inkubacije četiri dana, srednja vrijednost starosne dobi pacijenata s potvrđenim slučajem virusa 47 godina, od čega je otprilike 0,9% pacijenata mlađe od 15 godina, te da je otprilike 43,8% pacijenata ženskog spola. Najčešći simptom kod zaraženih osoba je groznica (43,8%), što je praćeno kašljem (67,8%), dok su mučnina (5%) i proljev (3,8%) manje zastupljeni simptomi (1,5). Oko 23,7% pozitivnih slučajeva boluje od već postojuće bolesti, kao što su povišen krvni pritisak ili hronična opstruktivna bolest pluća. U istom istraživanju, utvrđeno je da su na osnovu ozbiljnosti simptoma 926 (84,3%) pacijenata uvršteni u kategoriju blažih simptoma, dok je 173 (15,7%) pacijenta uvršteno u kategoriju težih simptoma. Pacijenti sa težim simptomima su pretežno starije osobe koje su bolovale od drugih bolesti prije infekcije. Dužina boravka u bolnici je bila oko 12 dana, a 91% hospitaliziranih ispitanika prvobitno je dijagnosticirano pneumonijom (1).

Prema preporuci Centra za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC), prioritetno testiranje se provodi za tri kategorije osoba: hospitalizirane pacijente sa simptomima COVID-19, druge simptomatske osobe sa povišenim rizikom od fatalnog ili lošeg ishoda, te osobe koje su imale bliski kontakt sa osobama koje su potvrđeni ili mogući slučajevi COVID-19 infekcije u roku od 14 dana od početka bolesti, ili su putovali u područje pogođeno pandemijom (6). Testiranje šire populacije je urađeno na Islandu, gdje je 13% ispitanika bilo pozitivno na SARS-CoV-2, slično kao i istraživanje iz grada Heinsberga u Njemačkoj, gdje je 14% ispitanika bilo pozitivno (7-8). Testiranje trudnica pred porođaj u New Yorku je pokazalo da je 15,4% pozitivno na SARS-CoV-2, gdje je većina pozitivnih trudnica (13.5%) bila bez simptoma bolesti (9).

Kako se testira prisustvo virusa?

Molekularna dijagnostika je trenutno zlatni standard za testiranje na SARS-CoV-2, a koristi se qRT-PCR metoda (kvantitativna lančana rekacija polimerazom nakon reverzne transkripcije). Uzorci se uzimaju iz gornjeg respiratornog trakta, a najčešće je u pitanju bris grla i nosa prikupljen nazofaringealno, s tim da se transport uzoraka do laboratorije vrši tako što se bris stavi na podlogu koja će doprinijeti očuvanju viralne RNK. Serum i urin su uglavnom negativni na prisustvo viralne nukleinske kiseline, bez obzira na stadij bolesti (6).

Nakon izolacije genetičkog materijala virusa, ribonukleinske kiseline (RNK), ista se procesom reverzne transkripcije prevodi u dvolančanu DNK. Test Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) se bazira na umnožavanju dva gena specifična za SARS-CoV-2, i to gen za RNK zavisnu RNK polimerazu (RdRP) i gen ovojnice (gen E). S druge strane, test razvijen od strane CDC-ja se bazira na amplifikaciji (umnožavanju) dvije regije gena nukleokapsida N1 i N2 i ljudskog RNaza P gena, kako bi se potvrdilo da je izolacija viralne RNK bila uspješna. Ukoliko je virus prisutan u testiranom uzorku, doći će do amplifikacije gore navedenih ciljanih regija viralnog genoma u toku reakcije koja se ciklično ponavlja 45 puta. Prateći porast prisutnosti viralnih gena u stvarnom vremenu, moguće je odrediti da li je nalaz pozitivan ili ne (10). Sažetak procesa molekularnog testiranja predstavljen je na ilustraciji (Slika 2).

WHO također preporučuje korištenje pozitivnih i negativnih kontrola u svakoj reakciji, kako bi se osigurala tačnost rezultata. Tako se preporučuje korištenje negativne kontrole za izolaciju RNK i vode kao negativne kontrole za PCR reakciju, te pozitivne kontrole za izolaciju RNK i PCR. Pozitivan rezultat je potrebno potvrditi ponavljanjem PCR reakcije na istom uzorku ili testiranjem istog uzorka u drugoj laboratoriji (11).

Ukoliko se osigura praćenje svih preporuka za kontrolu kvalitete, molekularno testiranje na SARS-CoV-2 je iznimno osjetljivo i specifično, uz minimalnu opasnost od lažno pozitivnih ili lažno negativnih rezultata. Prema podacima Ministarstva civilnih poslova Bosne i Hercegovine od 23. aprila 2020. godine u 12:00 sati, u BiH su testirane 21432 osobe (6264 testiranih na milion stanovnika; Slika 3), od čega je 14131 342 potvrđenih slučajeva (Slika 4) sa 54 smrtna ishoda (Slika 5). Pod nadzorom se nalazi 9307 osoba, a izliječenih je 485 (12). Slika 6 prikazuje usporedbu procenta zaraženih u BiH sa globalnom zastupljenosti koronavirusa.

Svi navedeni podaci upućuju na važnost ispravne molekularne dijagnostike zaraze koronavirusom, kako zbog prisutnosti iste u BiH, tako i zbog pandemije na svjetskom nivou. Kroz dodiplomski studij na Internacionalnom Burch univerzitetu, studenti se na laboratorijskim vježbama upoznaju sa metodama izolacije, analize i amplifikacije nukleinskih kiselina i na taj način stiču teoretsko i praktično znanje neophodno za rad u oblasti molekularne dijagnostike, pa tako i u provođenju testova na infekciju koronavirusom. Također, naši studenti Master i doktorskog studija aktivno rade na praćenju infekcije, a isti trend planiramo nastaviti i u budućnosti kroz realizaciju Master teza na temu infekcije SARS-CoV-2, te objavu naučnih radova koji problematiziraju ovu temu.

• 

• 

Literatura:

1. Guan, W. J., Ni, Z. Y., Hu, Y., Liang, W. H., Ou, C. Q., He, J. X., … & Du, B. (2020). Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. doi: 10.1056/NEJMoa2002032.
2. Huang, C., Wang, Y., Li, X., Ren, L., Zhao, J., Hu, Y., … & Cheng, Z. (2020). Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. The Lancet, 395(10223), 497-506.
3. Perlman, S. (2020). Another decade, another coronavirus. New England Journal of Medicine, 382, 760-762
4. Zhu, N., Zhang, D., Wang, W., Li, X., Yang, B., Song, J., … & Niu, P. (2020). A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. New England Journal of Medicine. doi: 10.1056/NEJMoa2001017.
5. McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., & Bartee, E. (2009). Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews Immunology, 9(9), 645-655.
6. Cheng, M. P., Papenburg, J., Desjardins, M., Kanjilal, S., Quach, C., Libman, M., Dittrich, S., & Yansouni, C. P. (2020). Diagnostic Testing for Severe Acute Respiratory Syndrome-Related Coronavirus-2: A Narrative Review. Annals of Internal Medicine. doi: 10.7326/M20-1301.
7. Gudbjartsson, D. F., Helgason, A., Jonsson, H., Magnusson, O. T., Melsted, P., Norddahl, G. L., … &Stefansson, K. (2020). Spread of SARS-CoV-2 in the Icelandic Population. New England Journal of Medicine. doi: 10.1056/NEJMoa2006100.
8. Streeck, H., Hartmann, G., Exner, M., &Schmid, M.(2020). Vorläufiges Ergebnis und Schlussfolgerungen der COVID-19 Case-Cluster-Study (Gemeinde Gangelt). Pristupljeno 24. aprila 2020. godine na
9. Sutton, D., Fuchs, K., D’Alton, M., & Goffman, D. (2020). Universal screening for SARS-CoV-2 in women admitted for delivery. New England Journal of Medicine. doi: 10.1056/NEJMc2009316.
10. Corman, V. M., Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, D. K., …, & Drosten, C. (2020). Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance, 25(3), 2000045.
11. World Health Organization. (2020). Use of laboratory methods for SARS diagnosis. Pristupljeno 21. aprila 2020. godine na https://www.who.int/csr/sars/labmethods/en/
12. Ministarstvo civilnih poslova Bosne i Hercegovine. (2020). Službene informacije o koronavirusu u BiH. Pristupljeno 17. maja 2020. godine na http://mcp.gov.ba/publication/read/sluzbene-informacije-o-koronavirusu-covid-19